В организме человека постоянно синтезируется рибонуклеиновая кислота, необходимая для решения широкого спектра задач. Подавляющее большинство связанных с ней процессов происходит внутри клетки. В ядре на основе фрагмента ДНК собирается его временная копия — РНК, которая затем проникает в цитоплазму и тем или иным образом участвует в синтезе белков, необходимых для нормального функционирования организма. Но бывает так, что РНК должна поступать в организм извне, например, при вакцинации, для восполнения дефицита белка или выключения дефектного гена.
Главная проблема заключается в том, что молекула РНК относительно крупная и несет отрицательный заряд, из-за чего отталкивается от также отрицательно заряженной клеточной мембраны. Кроме того, ткани организма наполнены ферментами рибонуклеазами, которые быстро разрушают «беззащитные» молекулы. Чтобы преодолеть эти барьеры и всё-таки доставить РНК внутрь клетки, ученые используют различные методы, которые можно разделить на три основные категории. Химические и биологические методы хорошо подходят для вакцинации и генной терапии, тогда как физические — для точечной модификации клеток в лабораторных условиях.
Химические методы
- Липидные наночастицы. РНК упаковывают в крошечную каплю, состоящую из комплекса разных жиров, то есть липидов. Попадая в организм, эта оболочка связывается с белками крови, которые воспринимают её как обычный липопротеин. Преодолеть мембрану ей удаётся благодаря эндоцитозу — процессу поглощения клеткой питательных веществ. В эндосоме, то есть «буферной зоне» между мембраной клетки и внутриклеточным пространством, меняется уровень кислотности, что приводит к распаду как жировой оболочки, так и мембраны самой эндосомы. В результате свободная РНК проникает в цитоплазму.
- Полимерные наночастицы. Отрицательно заряженные молекулы РНК соединяются с органическим полимером, например полиэтиленимином, несущим положительный заряд. Когда клетка поглощает такой комплекс, известный как полиплекс, он также оказывается внутри эндосомы. Но в этом случае попытки закислить среду не приносят результата, так как полимер впитывает все поступающие ионы водорода. Клетка «в панике» начинает закачивать ещё больше ионов вместе с водой, из-за чего эндосома раздувается и лопается, а РНК оказывается внутри.
Биологические методы
- Экзосомы. Экзосомы — это крошечные пузырьки, которые клетки выделяют во внешнюю среду для обмена сигналами. Биологи научились использовать их как природную «курьерскую службу». В лаборатории РНК внедряют внутрь экзосом либо напрямую, либо путем модификации других клеток, например, стволовых. Полученный концентрат нанопузырьков очищают и вводят пациенту. Так как экзосомы имеют естественное клеточное происхождение, они беспрепятственно транспортируются по кровотоку, защищённые от разрушительного воздействия ферментов.
- Вирусоподобные частицы. За миллиарды лет эволюции вирусов их белковая оболочка превосходно адаптировалась к тому, чтобы распознавать клетки живых организмов и проникать в них со своим генетическим материалом. Искусственно созданные вирусоподобные частицы имеют белки, как у настоящих вирусов, но при этом полностью лишены инфекционных генов. Их место занимает целевая РНК, которая оказывается в цитоплазме, или полностью минуя эндосому, или «прорываясь» через её кислую среду.
Физические методы
- Электропорация. Клетки, взятые у пациента, помещают в специальную пробирку — кювету — с раствором, где находится огромное количество молекул РНК. Через кювету проходит очень короткий электрический импульс, и под действием электрического поля клеточная мембрана временно теряет свою стабильность. В ней образуются электропоры — крошечные отверстия, сквозь которые РНК проникает в клетку. Когда ток отключается, целостность мембраны восстанавливается, а нуклеиновая кислота остаётся внутри. После этого пациенту вводят его же собственные, но модифицированные клетки, которые распространяются по организму и начинают синтезировать терапевтические белки.
- Микроинъекция. Метод микроинъекции предполагает прямое введение РНК внутрь клетки с помощью специальной ультратонкой иглы. Как и в случае с электропорацией, процесс происходит в лаборатории — микроманипуляторы позволяют точечно навести инструмент диаметром в 1 микрометр, в десятки раз тоньше человеческого волоса. Инъекционная игла аккуратно протыкает мембрану клетки, а пневматический дозатор подаёт строго определённый объём раствора с РНК, который, как правило, измеряется в пиколитрах — 10-12 литров. После завершения процедуры мембрана затягивается с минимальным стрессом для клетки.
Автор текста Иван Стефанов
Изображение: Magnific
