Как узнать, более того — увидеть, что происходит клетке? Один из эффективных способов — внедрить в нее своего “агента”, благодаря которому исследователь сможет получить полное представление о том, что его интересует. Но любое вмешательство в живое не проходит бесследно и может привести к нежелательным последствиям. К счастью, уже есть и продолжают совершенствоваться особо тонкие биотехнологии, которые позволяют делать это с максимальной деликатностью. Такими методами пользуется в своей работе научный сотрудник группы биологии активных форм кислорода Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН кандидат биологических наук Дмитрий БИЛАН. Его исследования, в ходе которых он разрабатывает генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы для многопараметрической микроскопии в живых системах, поддержаны грантом Президента РФ. Команда молодого ученого добивается результатов мирового уровня. Наш корреспондент углубился в детали научного поиска исследователей.
— По своей природе генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы — это белковые молекулы, — рассказывает Дмитрий Сергеевич. — С их помощью стала возможной регистрация разных соединений или каких-то биологических параметров непосредственно в живых объектах любого уровня сложности: от единичных клеток до целых организмов. До появления таких индикаторов подобное было невозможно даже представить.
Обычно индикаторы состоят из сенсорной части, которая, например, специфично узнает исследуемое соединение и взаимодействует с ним, и светящейся части, позволяющей визуализировать эти взаимодействия. Сенсорную часть для индикаторов мы и наши коллеги подбираем среди разнообразия природных белков из разных организмов. В геноме клеток всех живых существ запрограммирован свой набор белков, которые, по сути, сами выполняют функции биологических сенсоров. Благодаря им клетки осуществляют постоянный мониторинг ключевых соединений метаболизма и корректируют его в зависимости от условий. Природа уже постаралась за нас, нам необходимо лишь найти ген подходящего белка.
Представим, что мы выделили из некоего организма такой белок, который специфично взаимодействует с интересной для исследователей молекулой. Дальше возникает вопрос: как сделать реакцию этого белка видимой? Как перевести непонятный язык клеточных процессов на более доступный для человеческого восприятия? В этом случае природа снова приходит на помощь ученым. Флуоресцентные белки (первый из которых был выделен из медузы) совершили революцию в биологических исследованиях и вывели их на совершенно новый уровень. Работы в этой области в 2008 году были отмечены Нобелевской премией. От наблюдения за красивыми светящимися морскими обитателями ученые сделали шаг в сторону изобретения мощнейшего инструмента биологических исследований. В нашем случае ген флуоресцентного белка можно вставить в ген отобранного сенсорного белка. В итоге мы получим светящийся сложный белок, который специфично взаимодействует с исследуемой молекулой. Свечение может то усиливаться, то угасать в зависимости от характера взаимодействий. Полученный ген индикатора легко внедрить в любую клетку или даже ткань живого организма. Наблюдая за динамикой интенсивности флуоресценции живого объекта, мы можем сказать, что происходит в конкретный момент времени.
— Какими преимуществами обладает многопараметрическая микроскопия, которая входит в арсенал методов ваших исследований?
— Этот перспективный метод научного познания позволяет регистрировать одновременно несколько параметров в одном живом объекте. Существует большая коллекция флуоресцентных белков, в том числе отличающихся своими спектральными характеристиками. В нашем распоряжении целая палитра желтых, зеленых, голубых, красных белков. На основе каждого из них можно создавать индикаторы. Более того, каждый тип может быть представлен несколькими цветными версиями. Сейчас разноцветных индикаторов не очень много, чаще всего они создавались на основе версий зеленого флуоресцентного белка, который был открыт первым. Преимущество разноцветных версий в том, что их можно комбинировать друг с другом в пределах одной системы. Например, индикаторы разных цветов могут быть направлены в разные органеллы одной клетки. Такой подход позволяет не только регистрировать сразу несколько биологических параметров, но и исследовать, как одни процессы влияют на другие.
— Расскажите подробнее о вашем проекте.
— Наша лаборатория давно занимается разработкой генетически кодируемых индикаторов. В этой области команда, в которой я работаю, занимает одну из лидирующих позиций в мире. В частности, мы разработали целую линию индикаторов для регистрации пероксида водорода — одного из видов активных форм кислорода. Сейчас эти инструменты широко используются по всему миру и незаменимы при многих исследованиях, посвященных изучению роли активных форм кислорода в живых клетках и тканях. Интересно, что пероксид водорода, как и другие виды активных форм кислорода, еще совсем недавно рассматривался только с негативной стороны. Ведь из-за своей высокой реакционной способности они могут вызвать окислительный стресс, повреждая клетки, что прочно ассоциировано с развитием целого ряда заболеваний, включая, например, нейродегенеративные, сердечно-сосудистые, онкологические. Но оказалось, что пероксид водорода выполняет важнейшую роль еще и в качестве сигнальной молекулы и участвует в регуляции клеточных реакций. На глобальном уровне молекула пероксида водорода крайне важна в процессах регенерации и старения. Эти сведения во многих случаях получены с помощью разработанных нами индикаторов. Есть и другие индикаторы, которые мы создали. В дальнейшем также планируем разрабатывать новые, которые можно было бы использовать в условиях многопараметрической микроскопии. Для этого у нас есть все необходимые навыки и ресурсы.
— Какое будущее у ваших исследований?
— Генетически кодируемые индикаторы — очень перспективное направление. Их разработка уже стала отдельной областью современной науки. Сегодня мы работаем над созданием индикаторов, которые позволят исследовать некоторые клеточные окислительно-восстановительные процессы в живых системах любого уровня сложности в режиме многопараметрической микроскопии. Окислительно-восстановительные процессы играют центральную роль в регуляции всех жизненно важных функций живых систем. До появления специфичных генетически кодируемых индикаторов исследования в живых системах некоторых таких процессов были просто невозможными.
Но в этой области по-прежнему остается множество вопросов. Например, как изменения одного процесса отражаются на другом? Какие из процессов связаны друг с другом? Одинаково ли они протекают в разных клеточных органеллах или в разных клетках тканей живого организма? На эти вопросы можно будет ответить, обладая надежными инструментами исследования. И мы вносим вклад в разработку таких подходов. Все хорошие индикаторы будут широко использоваться в области биологии и медицины. Некоторые из существующих уже позволяют проводить фундаментальные исследования ключевых процессов.
Особый интерес представляют исследования на уровне целого организма. Гены индикаторов легко можно направить в любые ткани и органы любых организмов. К настоящему времени уже существует впечатляющий набор организмов — от растений до млекопитающих, в клетки которых включены те или иные индикаторы. Создание цветных индикаторов, над чем мы и работаем, позволит осуществлять их комбинирование и получать еще больше информации о тех или иных процессах. Кроме того, клетки и организмы с комбинацией разных индикаторов можно будет использовать для тестирования лекарственных препаратов.
Создание многих препаратов направлено на ингибирование определенных реакций в клетке. С помощью индикаторов влияние нового препарата на тот или иной процесс легко можно проследить. Такие системы скрининга лекарственных препаратов уже созданы на базе некоторых индикаторов. В дальнейшем они будут лишь совершенствоваться, особенно с реализацией многопараметрического подхода регистрации.
В заключение прокомментирую представленные здесь фотографии живых человеческих клеток, полученные в режиме многопараметрической флуоресцентной микроскопии. Клетки содержат одновременно три флуоресцентных белка: красный — индикатор для регистрации пероксида водорода, зеленый визуализирует рецепторы эпидермального фактора роста, голубой — индикатор для регистрации ионов кальция. Все три параметра регистрируются в режиме реального времени в каждой клетке. Стимуляция клеток фактором роста вызывает перемещение рецепторов внутрь клеток, всплеск кальция и последующую продукцию пероксида водорода.
Фирюза ЯНЧИЛИНА
Иллюстрации предоставлены Д.Биланом
Нет комментариев