Исследователи Института химической биологии и фундаментальной медицины им. Д.Г.Кнорре СО РАН сделали важный шаг к созданию отечественной технологии безматричного ферментативного синтеза ДНК. Они детально описали молекулярный механизм действия определенных ферментов, что открывает путь к инженерии эффективных биокатализаторов для синтеза протяженных фрагментов ДНК — ключевой задачи современной синтетической биологии. Результаты цикла работ опубликованы в журналах Int. J. Mol. Sci., «Биохимия» и International Journal of Biological Macromolecules.
Синтез длинных молекул ДНК — сложный и трудоемкий процесс. Химический метод, широко используемый для получения коротких олигонуклеотидов, на практике имеет верхнюю границу 100–150 нуклеотидов. Для сборки более длинных последовательностей, например полноразмерного гена (около 1000 нуклеотидов) или целого ферментативного каскада (10 000 нуклеотидов), ученым приходится «сшивать» множество коротких фрагментов. Это приводит к ошибкам, разрывам и требует последующей проверки и исправления.
Ферментативный синтез рассматривается как перспективная альтернатива. Он позволяет наращивать цепь ДНК по одному нуклеотиду в заданном порядке, подобно тому, как это происходит в живой природе, но с использованием модифицированных «строительных блоков». Это позволяет получить длинные молекулы ДНК «в один прием», без необходимости сборки из множества коротких «кусков».
Однако для эффективной работы такой технологии нужны специальные катализаторы — ферменты класса терминальных нуклеотидилтрансфераз, которые будут эффективно узнавать и присоединять модифицированные нуклеотиды, что позволит проводить пошаговый синтез нуклеиновых кислот заданной последовательности.
Используя методы ферментативной кинетики и структурного моделирования, ученые изучили, как фермент человека взаимодействует с праймером и входящим нуклеотидом (модифицированным нуклеозидтрифосфатом). Было показано, что ключевую роль в катализе играют конформационные перестройки — динамические изменения структуры белка и субстратов, отвечающие за эффективность химической реакции между ними.
«Знание механизма действия фермента и особенностей формирования каталитического состояния позволяет целенаправленно проводить инженерию белковой молекулы с целью ускорения определенных стадий взаимодействия, —рассказывает член-корреспондент РАН Никита Александрович Кузнецов, заведующий лабораторией генетических технологий ИХБФМ СО РАН, руководитель гранта РНФ № 21-64-00017П. — То есть, разобравшись в механизме, мы способны влиять на эффективность действия фермента путем сайт-направленного мутагенеза и химеризации структурно-гомологичных элементов, применяя подходы рационального дизайна».
На данный момент работа по адаптации и апробации технологии продолжается. Ученые подчеркивают, что успех в этой области — результат совокупного труда нескольких групп: биохимиков, отвечающих за создание эффективного биокатализатора, химиков, создающих модифицированные нуклеотиды и разрабатывающих твердофазные системы для синтеза, и биотехнологов, проводящих апробацию и оптимизацию отдельных этапов технологии ферментативного синтеза.
Возможность эффективно получать длинные фрагменты ДНК позволит исследователям создавать искусственные генные конструкции. В будущем это может найти применение в самых разных областях — от создания новых метаболических путей до разработки вакцин и диагностических систем.
Изображение: структура кармана активного центра терминальной нуклеотидилтрансферазы человека. Показаны некоторые функционально-важные аминокислотные остатки, ДНК-праймер и входящий нуклеозидтрифосфат.
Источник:
