Ученые Института химической биологии и фундаментальной медицины им. Д.Г.Кнорре СО РАН обнаружили новый механизм повышения точности копирования ДНК. Полученные данные меняют представление о том, как осуществляется защита клетки от мутаций, могут быть использованы не только в фундаментальной биохимии, но и фармакологии. Результаты работы, выполненной в рамках проекта РНФ, опубликованы в журнале Biochemistry.
Точность репликации ДНК — одна из основ генетической стабильности. ДНК-полимеразы — ферменты, копирующие ДНК — делают примерно одну ошибку на 10 000 – 100 000 включенных нуклеотидов. Однако подавляющее большинство исследований их точности проводятся на упрощенных системах, состоящих только из ДНК-матрицы и короткого олигонуклеотида-затравки (праймера), тогда как в клетке полимеразы часто работают в условиях, требующих вытеснения цепи ДНК перед собой.
Исследователи ИХБФМ СО РАН показали, что необходимость расплетать двойную спираль впереди движущегося фермента служит дополнительным фильтром точности. Они сравнили эффективность и точность удлинения праймера в отсутствие и в присутствии вытесняемой цепи, используя два белка, достаточно сильно различающихся между собой — фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli и ДНК-полимеразу фага RB69. Варьируя силу разрываемых пар нуклеотидов, ученые количественно оценили, как энергия их разрушения влияет на кинетику правильного и ошибочного включения нуклеотидов. Оказалось, что присутствие вытесняемой цепи повышает точность синтеза в несколько раз по сравнению с праймер-матричной системой. Причем чем прочнее пара нуклеотидов, которую полимеразе приходится разрывать, тем выше точность работы полимеразы.
Авторы предлагают физико-химическое объяснение: присоединение правильного нуклеотида высвобождает достаточное количество энергии, чтобы обеспечить не только химическую стадию реакции, но и конформационную перестройку, необходимую для расхождения цепей. При ошибочном включении энергетический выход реакции ниже, и его не хватает для преодоления энергетического барьера, создаваемого двуцепочечной ДНК, которую нужно расплести.
«До сих пор считалось, что точность определяется исключительно структурой активного центра фермента. Мы показали, что сама механическая нагрузка — необходимость разрывать ДНК впереди себя — выступает в роли независимого контролера качества. Природа нашла элегантный способ заставить полимеразу работать аккуратнее, просто усложнив ей задачу», — комментирует руководитель гранта РНФ Анна Юдкина, старший научный сотрудник лаборатории геномной и белковой инженерии ИХБФМ СО РАН.
Многие современные подходы генной инженерии используют полимеразы со способностью к вытеснению цепи. Понимание механизма точности копирования ДНК позволяет оптимизировать такие методики и конструировать варианты ДНК-полимераз с измененной специфичностью — более точные, если нужно избежать ошибок, или, наоборот, более склонные к неправильному включению нуклеотидов для генерации разнообразия в технологиях молекулярной эволюции.
Источник: пресс-служба Института химической биологии и фундаментальной
медицины СО РАН
