Ученые из Института химической биологии и фундаментальной медицины им. Д.Г. Кнорре СО РАН и Новосибирского института органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН разработали инновационный подход для изучения электростатических взаимодействий в ферментах, восстанавливающих повреждённую ДНК. Созданный метод с pH-чувствительной меткой можно применить к сотням других белков, работающих с ДНК, многие из которых очень важны для предохранения организма от онкологических заболеваний. Результаты исследования, поддержанного Российским научным фондом и Минобрнауки РФ, опубликованы в Journal of Physical Chemistry B: Condensed Matter, Materials, Surfaces, Interfaces and Biophysical.
В основе работы любого живого организма лежат ферменты — белки, которые ускоряют химические реакции. Ключевую роль в этом ускорении играют электростатические взаимодействия, то есть силы притяжения и отталкивания между заряженными частицами. Фермент работает как высокоточный станок, а «детали», которые он обрабатывает, должны быть идеально подогнаны друг к другу. Электрические заряды помогают направлять молекулы-субстраты в нужное место, «включать» и «выключать» химические связи.
Ученые использовали метод спектроскопии электронного парамагнитного резонанса, который позволяет изучать молекулы с неспаренными электронами — так называемые спиновые метки. В центре внимания оказался бактериальный фермент формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза (Fpg), который участвует в репарации ДНК. Его задача — найти и вырезать из ДНК окисленные остатки гуанина, иначе в месте повреждения произойдет мутация. У человека есть аналоги Fpg — белки семейства NEIL, защищающие клетки от мутаций, которые могут дать начало онкологическому процессу. Было известно, что в активном центре всех этих ферментов работают две аминокислоты — пролин и глутамат, но как именно они взаимодействуют, до сих пор оставалось загадкой.
«Наши коллеги синтезировали спиновую метку, которая чувствительна к кислотности среды, а мы пришили ее к ДНК прямо рядом с местом повреждения. Получился своеобразный молекулярный «микрофон», который в прямом смысле передает сигнал из центра событий: изменение зарядов вблизи метки меняет ее ответ на pH», - рассказывает академик Дмитрий Жарков, заведующий лабораторией геномной и белковой инженерии ИХБФМ СО РАН.
«Химики в нашем институте являются признанными лидерами в области синтеза спиновых меток. Именно благодаря их богатому опыту удалось создать специальную метку, чувствительную к pH. Механизм этой чувствительности основан на том, что метка выступает в роли основания: при повышении pH доля её заряженной (протонированной) формы уменьшается. На процесс сильно влияют окружающие электростатические взаимодействия. Обе формы метки — и заряженная, и нейтральная — парамагнитны, их соотношение четко отражается на спектре ЭПР, анализом которого виртуозно владеют специалисты Лаборатории магнитного резонанса НИОХ СО РАН», - поясняет Елена Багрянская, директор НИОХ СО РАН, руководитель гранта РНФ.
Ученые обнаружили, что в кислой среде и нормальный фермент, и его мутантный вариант с заменой каталитического глутамата на нейтральный глутамин ведут себя одинаково. Но как только pH сдвигается к физиологическим значениям, сигналы резко расходятся. В работающем ферменте происходит «перезарядка» — пролин и глутамат обмениваются протоном, что приводит фермент в активное состояние, а мутант на это не способен. Из этих данных удалось даже определить разницу в электрическом потенциале активного центра обоих вариантов Fpg, которая составила около 30 милливольт. Такое прямое измерение электростатических взаимодействий внутри фермента проведено впервые в мире.
Предложенный метод легко адаптируется для изучения других белков, работающих с ДНК, особенно там, где важны локальные заряды – например, для белков семейства NEIL, мутации в которых связаны с развитием рака, воспалительных заболеваний и нарушениями эмбрионального развития.
Источник: пресс-служба Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
Изображение: разработано Мagnific.
