Ученые подведомственного Минобрнауки России Пензенского государственного университета (ПГУ) запатентовали способ определения возбудителей инфекций при помощи тензиометрии. Разработка позволяет идентифицировать патогенный микроорганизм быстрее рутинного бактериологического метода, при этом процедура безопасна для медперсонала, поскольку лаборанты работают с инактивированным патогеном, а сам анализ не требует значительных финансовых затрат. В Пензе действенность способа проверена на 30 пробах биологического материала пациентов клинических больниц города. В настоящее время метод активно применяется в Пензенской областной клинической больнице имени Н. Н. Бурденко.
Болезнетворные микроорганизмы остаются одной из главных причин заболеваний, способных привести к инвалидизации и летальным исходам. По статистике, бесконтрольное использование противомикробных средств за последние годы привело к появлению штаммов, устойчивых к антибиотикам. Один из разработчиков способа, кандидат медицинских наук, доцент кафедры «Хирургия» ПГУ Елена Феоктистова, обращает внимание, что своевременная идентификация возбудителя до начала антибактериального лечения — приоритетная задача здравоохранения.
Например, в хирургической практике одной из важнейших проблем является присоединение и развитие нозокомиальной (внутрибольничной) инфекции на фоне роста резистентности микрофлоры. Частота развития нозокомиальной инфекции в хирургических стационарах достигает 21,1%. Несмотря на достигнутые успехи в бактериологических исследованиях, проблема далека от решения, — отметила она.
В медицинской практике для лабораторной диагностики инфекционных процессов применяется несколько основных методов. Наиболее распространенный — бактериологический. Биоматериал инкубируют в питательной среде и ожидают роста колоний. Минимальный срок вызревания — сутки, а при низкой концентрации микроорганизма — до трех дней. Метод требует специально оборудованной лаборатории, высокоспециализированного персонала и высокотехнологичного оборудования. Биохимический метод выявляет возбудителя за счет определения ферментов микроорганизма, однако при малой концентрации возбудителя высок риск ложноотрицательных результатов, а некоторые «прихотливые» бактерии этим методом диагностировать невозможно. Биологический метод, предполагающий заражение лабораторных животных исследуемым материалом, является самым дорогостоящим и применяется крайне редко.
Большинство этих методов требуют специально оборудованной лаборатории и времени для их проведения. В ожидании результата от лаборатории пациент может получать неэффективную терапию. Последствия могут быть самыми разными, — поделилась Елена Феоктистова.
Ученые Медицинского института ПГУ совместно с медиками пензенских больниц предложили способ идентификации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в разных областях медицины — хирургии, терапии, гинекологии и других. Метод основан на тензиометрии — измерении поверхностного натяжения жидкости. Исследователи измеряют показатели поверхностного натяжения раствора, содержащего инактивированные продукты жизнедеятельности и лизат микроорганизмов, и сравнивают их с ранее полученными значениями для известных видов микробов. Инактивированные продукты жизнедеятельности и лизат — это метаболиты, вырабатываемые микроорганизмами, а также остатки их клеточных структур после гибели. Такие препараты не содержат живых бактерий.
В состав микроорганизмов входят различные низко- и высокомолекулярные поверхностно-активные вещества. Каждый вид микроорганизма продуцирует свой уникальный набор ПАВ. Это и формирует видоспецифичный тензиометрический профиль — характерную кривую изменения поверхностного натяжения. Именно эта видоспецифичность и лежит в основе нашего метода, — рассказала Елена Феоктистова.
Перед разработкой способа исследователи совместно с сотрудниками лаборатории Пензенского областного клинического центра специализированных видов медицинской помощи создали эталонную базу с музейными культурами бактерий — чистыми, идентифицированными и охарактеризованными штаммами из специализированных коллекций. Были исследованы величины динамического поверхностного натяжения 48 образцов музейных культур по 16 проб каждая: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus faecalis. Для каждого микроорганизма создана модель, загруженная в специально разработанную программу со встроенной нейронной сетью. Эти модели стали эталонными числовыми значениями показателей поверхностного натяжения. Опытным путем доказано, что именно они оптимальны для чувствительной и специфической идентификации разных видов микроорганизмов.
Кроме того, были исследованы девять образцов гнойного содержимого с неизвестными микроорганизмами, то есть проверка проводилась не только на чистых культурах, но и на реальном клиническом материале, — добавила Елена Феоктистова.
Процедура анализа по предложенному способу проходит в несколько этапов. Забор биологического материала проводится как в классических методах: стерильным ватным тампоном лаборант набирает биоматериал и помещает его в пробирку с 5 мл свежеприготовленного мясопептонного бульона. Пробирку выдерживают в термостате при температуре 37 градусов Цельсия в течение 18–48 часов в аэробной атмосфере при влажности 80%. На следующем этапе пробирку помещают в автоклав на 20 минут при температуре 132 градуса Цельсия, где микроорганизм полностью деактивируется, остаются только продукты его распада, лизат. Риск заражения персонала после этого этапа равен нулю. Затем пробирки центрифугируют в течение 5 минут при 3000 оборотов в минуту: на дне образуется осадок, а надосадочная жидкость становится однородной субстанцией для дальнейшего анализа.
Полученную жидкость набирают в капилляр с помощью шприца для жидкостной хроматографии и микрометрического регулятора и помещают в камеру тензиометра. Достаточно всего 0,5 мл раствора. На выходе из капилляра с помощью автоматического шприца системы навешивают каплю, и величина поверхностного натяжения как функция времени измеряется по форме капли, — поделилась Елена Феоктистова.
Первую каплю сбрасывают и формируют следующую, после чего включают измерение.
Дальше все делает техника. Аналоговый сигнал от видеокамеры поступает в видеопроцессор, где трансформируется в цифровой, и полученные данные анализируются компьютером, — добавила разработчик.
Всего 100 секунд достаточно для определения вида микроорганизма в пробе. На экране компьютера появляются числовые значения показателей поверхностного натяжения и графическое изображение, которые сопоставляют с эталонными моделями.
Медики и ученые ПГУ провели клинические исследования с разрешения Локального этического комитета при Пензенском госуниверситете. Было проверено около 30 проб биологических материалов пациентов из двух больниц: Клинической больницы № 6 имени Г. А. Захарьина и Пензенской областной клинической больницы имени Н. Н. Бурденко. Исследования проводились на материале пациентов с различными патологиями: абсцессы различных локализаций, нагноение послеоперационной раны, гнойные инфицированные раны.
Достоверность заявленного способа идентификации доказана в лабораторных и клинических условиях. Вид микроорганизмов в 100 процентах случаев подтвержден традиционным бактериологическим методом, — констатировала результат Елена Феоктистова.
Для определения вида микроорганизма предложенным способом не требуется высокоспециализированный персонал. Идентификация выполняется нейросетью автоматически, без субъективной оценки, что исключает человеческий фактор.
С новым способом врач может начать специфическую терапию значительно раньше, чем при традиционном бактериологическом исследовании. Это особенно важно для пациентов с тяжелыми инфекциями, где каждый день промедления может усугубить течение заболевания и привести к летальному исходу, — уверена Елена Феоктистова.
Источник: Минобрнауки России
