Водоемы хранят ценную информацию о жизни их обитателей
Когда вы слышите, что сократилась популяция того или иного вида рыб, у вас может возникнуть вопрос: а как можно отследить этих животных в их естественных местах обитания? Оказывается, есть довольно нестандартные способы таких наблюдений. Старший научный сотрудник Национального научного центра морской биологии им. А.В.Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук Сергей ТУРАНОВ разрабатывает неинвазивные методы мониторинга ценных и исчезающих видов рыб Дальнего Востока России. В своих исследованиях он использует ДНК из окружающей среды. На эту работу он получил молодежный грант Президента РФ.
— Сергей, какие виды рыб вы изучаете? Чем они ценны и каковы причины того, что они находятся под угрозой исчезновения?
— Мой интерес сконцентрирован в первую очередь на нескольких группах морских рыб. Они «сумели отличиться» в кругу своих сородичей тем, что формировали видовое разнообразие «неправильно». С одной стороны, это проявляется в наличии среди них криптических видов, или видов-двойников, которые внешне идентичны, но существенно отличаются по структуре геномов и репродуктивно изолированы друг от друга. С другой, — среди них есть виды внешне совершенно разные, но не проявляющие существенных отличий друг от друга на уровне ДНК. Я пытаюсь понять, что способствовало этой «неправильности».
Цель нашего проекта — оценить разнообразие рыб, которые водятся на Дальнем Востоке России. Но ловить не их, а ДНК, которую они оставляют в воде. При этом я исходил из того, что ограничение района работ одним регионом — стратегия ошибочная. Рыбы не знают политических и региональных границ. Поэтому сведения собирал для всей территории страны.
По данным разных источников, в России насчитывается около тысячи видов рыб и рыбообразных. Из них к видам, находящимся в уязвимом положении (рискующим стать вымирающими), можно отнести 20. Примерно столько же видов находятся под угрозой исчезновения. Критерии, по которым виды причисляют к этим категориям, разработаны Международным союзом охраны природы.
Под угрозой исчезновения находятся девять видов из отряда осетрообразные. Это знакомые всем осетры и белуги. Их истребляют быстрее, чем они успевают размножиться, ведь наступление половой зрелости у них происходит на пятнадцатом-двадцатом году жизни. Естественных популяций этих видов практически не осталось. Поиск сохранившихся популяций желательно проводить неинвазивным способом.
В ходе проекта мы отрабатываем одно из направлений такой методики. В качестве исчезающего вида мы выбрали Acipenser mikadoi — это сахалинский осетр. Его успешно разводят в Амурском филиале «Главрыбвода». Естественная популяция еще сохраняется в реке Тумнин Хабаровского края. Мы ставили перед собой задачу отработать методы на искусственно поддерживаемой популяции сахалинского осетра и применить их для мониторинга популяции естественной.
— Расскажите подробнее о подходе, который вы применяете в исследованиях.
— Неинвазивные методы мониторинга биологического разнообразия — те, которые не требуют отлова гидробионтов (морских и пресноводных организмов). К ним чаще всего относят три метода: гидроакустический, на основе распознавания изображения гидробионтов с помощью обученных нейросетей, а также использование ДНК из окружающей среды. Мы разрабатываем последний.
ДНК из окружающей среды (или, как ее называют, средовая) может быть получена из воды, почвы, снега, пыли и многих других источников. Каждый организм постоянно сбрасывает определенное количество ДНК вместе с отмершими клетками обновляющихся тканей. Сегодня публикуется большое количество работ, рассматривающих скорость и количество сброса разными организмами ДНК в окружающую среду (в зависимости от размера, жизненной стадии, условий среды), а также темпы ее распада в естественных условиях.
Используя ряд молекулярно-генетических методик, можно получить сведения о присутствии тех или иных организмов в том или ином месте. Обсуждаются возможности оценки биомассы и генетического разнообразия организмов с помощью средовой ДНК. Метагеномные подходы позволяют оперативно получить информацию о функционировании целых экосистем. Они основаны на применении всей ДНК из какого-либо образца. В нашем случае — из воды.
— Как технически выглядит мониторинг?
— Начинаем со сбора ДНК из водной среды. Определенный объем воды из какого-то источника пропускается через особые шприцевые фильтрующие насадки. Применение именно этого способа для нас обусловлено необходимостью избавления от перекрестной контаминации (загрязнения образца чужеродной ДНК). Мы разработали набор, аналог того, что производит NatureMetrics — британская компания, использующая передовые генетические методы для мониторинга биологического разнообразия. Следующий этап — выделение ДНК из фильтров. Затем происходит разделение на два принципиально разных направления: идентификация единичных видов (в нашем случае сахалинского осетра) и экспресс-мониторинг видового разнообразия рыб.
Для первого необходима разработка тест-системы, схожей с тестом для выявления носителей новой коронавирусной инфекции. Образцы, в которых есть ДНК сахалинского осетра, покажут ее наличие даже при очень малой концентрации. Для второго направления нужна предварительная наработка большого количества копий определенных универсальных фрагментов генома, с помощью которых можно будет определить, какие виды внесли вклад в формирование образца средовой ДНК.
Далее эти фрагменты подвергаются высокопроизводительному секвенированию. В результате мы получаем огромное количество прочтений — коротких строчек текста. С помощью средств биоинформатики производится контроль качества полученных прочтений, восстанавливается привязка их к конкретным образцам средовой ДНК.
Затем выявляются группы прочтений с наименьшими взаимными отличиями, то есть выполняется разбиение на операционные таксономические единицы (ОТЕ) — аналоги биологического вида. На завершающем этапе происходит поиск соответствия ОТЕ известным видам гидробионтов путем сравнения их с теми, которые уже зарегистрированы в геномных базах данных.
В итоге мы можем получить информацию о количестве видов, обитающих на определенной территории (акватории) на момент сбора образцов.
Проблема и одновременно преимущество метода состоят в том, что внеклеточная ДНК в водной среде может распасться на свету до очень маленьких, не детектируемых фрагментов в течение нескольких недель. А значит, нужен экспресс-метод. Для его отработки мы собирали образцы из аквариумов Приморского океанариума. После проведения всех работ и выполнения видовой идентификации ОТЕ, которые сформированы на основе прочтений, полученных от средовой ДНК обитающих в аквариуме рыб, мы должны составить список гидробионтов, которые в нем обитают. Наличие последовательностей ДНК видов, которых не было в аквариуме, а также отсутствие тех видов, которые там точно есть, может свидетельствовать о перекрестной контаминации образцов на каком-либо этапе эксперимента или о несовершенстве метода в целом.
— Можно ли, исходя из ваших исследований, уже сделать какие-то выводы?
— Пока опубликованы только результаты работы по формированию локальной базы данных рыб, которая интегрирована в глобальную геномную базу. Генотипирован ряд представителей морской и пресноводной фауны рыб Дальнего Востока. Для них мы получили данные о нуклеотидной изменчивости последовательностей одного из митохондриальных генов. Они позволяют выявить пороги разграничения внутри- и межвидовых значений изменчивости. Такие результаты в будущем можно использовать для более точной процедуры кластеризации последовательностей в ОТЕ, так как при их недоучете повышается риск ложноотрицательных результатов.
Для идентификации сахалинского осетра мы провели отбор воды из аквариумов, в которых содержатся их разновозрастные особи. Выделили ДНК, разработали и успешно апробировали набор видоспецифичных олигонуклеотидов (праймеров) — это искусственно синтезированные метки, состоящие из того же текста, что и ДНК. На основе принципа комплементарности эти метки связываются со специфичными участками ДНК тех видов, для которых они разработаны, и ни в коем случае, то есть никогда, не должны связываться с ДНК других видов.
Также мы обработали первые данные высокопроизводительного секвенирования для рыбок из аквариумов Приморского океанариума — получили много текста ДНК и начали его анализировать. Там, кстати, вышел казус. Довольно большое количество прочтений при секвенировании средовой ДНК из аквариумов определялись как виды рода Oncorhynchus (тихоокеанские лососи), что поначалу повергло нас в уныние. Этих рыб в аквариумах не было. Выяснилось, что измельченное филе горбуши, кеты и некоторых других видов рыб используется для кормления обитателей этих аквариумов.
В то же время некоторые виды нам выявить не удалось. Около трети рыб, обитающих в аквариумах, не генотипированы и не имеют последовательностей в глобальных геномных базах данных. Думаю, тех же результатов стоит ожидать и от проб из естественной среды (моря, реки, озёра). В этом проявляются основные недостатки подхода, а значит, нам еще есть над чем работать для его усовершенствования.
Василий Янчилин
Нет комментариев