Разработкой микрофлюидных устройств для определения биомаркеров в крови человека для скрининга онкологических заболеваний и оценки риска развития аллергических заболеваний занимаются научные сотрудники лаборатории микрофлюидных технологий Института медицины и медицинских технологий Новосибирского государственного университета, которая в дальнейшем будет располагаться на площадях нового кампуса НГУ, возводимого в рамках национального проекта «Молодежь и дети».
Микрофлюидика — это технология, которая изучает поведение жидкостей и газов в микроскопических каналах и структурах. Она предоставляет возможность управлять малыми объемами жидкости, обеспечивая высокую чувствительность и эффективность в различных приложениях. Микрофлюидика с использованием флуоресцентных, оптических и электрохимических детекторов находит широкое применение в различных областях, включая аналитическую химию, биомедицину и биотехнологию. Её используют для анализа биологических образцов, обнаружения биомаркеров, диагностики болезней и мониторинга реакций организма.
Микрофлюидное устройство (микрофлюидный чип) — это компактный лабораторный прибор, который управляет микроскопическими объемами жидкостей (от нескольких микро- до пиколикров), протекающими по системе тонких каналов размером в десятки или сотни микрометров. Сами чипы изготавливают из полимерных материалов, стекла, кремния, керамики или металлов. Устройство представляет собой сеть микроканалов, вырезанных, вытравленных или отлитых в материале подложки (стеклянной, кремниевой или полимерной). Устройство считается микрофлюидным в том случае, когда как минимум один размер канала находится в микрометровом диапазоне, при этом оно использует или контролирует малые объемы жидкости, что позволяет минимизировать расход реагентов. Очень низкие скорости потока жидкости в таких устройствах позволяют улучшить эффективность массообмена и повысить чувствительность анализа.
В настоящий момент научные сотрудники лаборатории заняты тремя ключевыми разработками. Они создают микрофлюидную платформу для количественного анализа простат-специфического антигена (ПСА), онкомаркеров (CA-125 и HE4) рака яичников и для полуколичественного определения иммуноглобулинов класса Е специфических к бытовым аллергенам. Уже созданы первые прототипы аналитических чипов для количественной детекции ПСА с целью скрининга рака предстательной железы. На данный момент в лаборатории проводится отработка методов для комбинированного анализа онкомаркеров для верификации гинекологических новообразований на ранних стадиях.
— Актуальность данной работы обусловлена тем, что современная программа онкоскрининга, входящая в одно из направлений диспансеризации, не затрагивает все виды рака и представляет собой большое количество самостоятельных анализов в крупных диагностических центрах или специализированных лабораториях. Еще одним недостатком такого подхода является высокая стоимость проведения анализа крови на онкомаркеры. Поэтому наиболее перспективными для решения проблем онкоскрининга считаются микрофлюидные устройства, которые обладают рядом преимуществ, например, возможностью проведения нескольких видов анализа на одном устройстве, использованием малого количества реагентов и скоростью выполнения анализа. Предполагается, что разработанные нами устройства будут просты в использовании и способны выдавать результаты в течение 20-30 минут, пока пациент находится на приеме у врача, — рассказала заведующая лабораторией микрофлюидных технологий ИММТ НГУ Ксения Миняйло.
В процессе разработки также находится и экспресс-чип для аллергодиагностики, который станет важным элементом портативной системы для оценки риска развития аллергического заболевания. Всего за 15–20 минут по одной капле крови тест выявляет аллергию на кошек, собак или клещей домашней пыли. Своевременное обнаружение триггеров позволяет пациенту сразу исключить контакт с аллергеном, скорректировать быт и вовремя начать направленную терапию.
— Важно понимать, что наши микрофлюидные устройства не станут альтернативными методами онкодиагностики или выявления аллергенов. Наша цель — не заменить врача, а дать ему инструмент для «стартовой маршрутизации» пациентов, — уточнила Ксения Миняйло.
Устройство работает следующим образом: капля крови пациента попадает в зону введения образца, где отделяется плазма, которая движется по микроканалу в зону конъюгации. Если целевой белок присутствует в крови, происходит его связывание с меченным антителом и далее потоком по микроканалу он движется до зоны детекции, которая начинает светиться, что позволяет быстро считать сигнал и получить результат. Сейчас учёные оптимизируют реагентную базу и методику иммобилизации антител и антигенов на полимере, чтобы добиться высокой чувствительности. Сначала фокус на точном определении одного биомаркера на чипе; следующим шагом станет переход к мультиплексной платформе, позволяющей параллельно анализировать несколько биомаркеров. Также они получают меченные антитела, с помощью которых можно качественно или количественно определять искомые биомолекулы в крови. Также рассматривается возможность полной автоматизации от считывания сигнала с помощью смартфона или специального ридера до появления результатов на компьютере или в специальном приложении, что сделает использование устройства более удобным и эффективным.
Параллельно ведется работа по оптимизации технологии создания прототипов микрофлюидных устройств из термопластичных полимеров с помощью метода лазерной абляции. Данной работой заняты студентки-биологи магистратуры Передовой инженерной школы (ПИШ) НГУ и молекулярной биологии Вероника Сачкова и Марина Кузнецова под научным руководством.
Если говорить о материалах и технологии производства, то полимер PDMS (полидиметилсилоксан) популярен благодаря оптической прозрачности, гибкости и биосовместимости, поэтому его часто используют для изготовления мкробиосенсоров. Однако для масштабного производства одноразовых микрофлюидных платформ всё чаще применяются термопласты — такие как полиметилметакрилат (PMMA), поликарбонат (PC) и полистирол (PS). Один из самых распространенных методов печати — мягкая литография, которая применяется для быстрого прототипирования чипов из PDMS. Процесс включает создание мастер-формы (чаще всего с помощью фотолитографии) и заливку жидкого PDMS, который после отверждения снимается с формы. Производство микроканалов из полимеров осуществляется либо с помощью методов репликации, таких как литье под давлением, термоформование с литьем, микрофрезерование, либо с помощью фотодетерминированных методов, таких как литография и лазерная резка. Среди этих производственных процессов абляция материала с помощью CO2-лазера является недорогим и быстрым методом, обеспечивающим высокую точность, аккуратность и гибкость. Использование процесса лазерной абляции полимеров позволяет очень быстро вырезать микроканалы с минимальным гидравлическим диаметром 80 мкм. Немаловажным аспектом является правильный выбор режимов лазерной резки, от чего зависит форма и шероховатость поверхности каналов. Для регулировки скорости потока исследуемой жидкости учитывается не только диаметр канала, его длина, но и гидрофильность/гидрофобность поверхности микроканалов для последующей работы с биомолекулами.
В будущем планируется перенести отработанную иммунохимическую схему на готовый прототип микрофлюидного устройства, специально спроектированного для детекции конкретных биомаркеров. Также поставлена задача разработать полуколичественный метод оценки степени тяжести аллергии с градацией сигнала на низкий/средний/высокий. Кроме того, ученые лаборатории намерены создать прототип, пригодный для домашнего использования, обладающий такими свойствами, как интегрированная пробоподготовка, простота эксплуатации, визуальная или полуколичественная оценка без сложного оборудования. В перспективе — создание мультиплексного онкочипа, который сможет работать не только в лабораторных условиях, но и непосредственно в кабинете врача.
— Процесс создания микрофлюидных чипов и устройств включает использование специализированных и дорогостоящих материалов, таких как стекло, кремний, полимеры высокой чистоты и использование сложных технологий. В процессе изготовления могут возникать потери реагентов из-за адсорбции на поверхности каналов или неправильной конструкции устройства, что может привести к неточным результатам анализа или снижению эффективности реакции. И, наконец, контроль потока жидкости может быть сложным из-за малого размера каналов и ограничений в управлении давлением и скоростью потока, что может потребовать использования сложных насосов и клапанов или дополнительных манипуляций для достижения нужных условий. Несмотря на имеющиеся недостатки, микрофлюидика продолжает активно развиваться, и многие из этих ограничений могут быть учтены и преодолены с помощью новых научно-технологических решений. Микрофлюидная технология позволяет управлять очень малыми объемами жидкости, в том числе существенно меньше, чем капля крови, и обладает рядом других преимуществ. Разрабатываемые микрофлюидные платформы в разы ускоряют и удешевляют анализ ключевых биомаркеров, поскольку при их применении отсутствует необходимость привлечения лабораторной инфраструктуры, — пояснила Ксения Миняйло.
Аналоги всем трем разработкам уже существуют — одни уже представлены на рынке, другие пока находятся на стадии разработки. Единственным одобренным FDA (Food and Drug Administration, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, федеральное агентство при Министерстве здравоохранения США) в 2019 году тестом является количественный экспресс-тест (Point-of-Care-тест) для определения общего ПСА, разработанный компанией OPKO Health (ранее Claros Diagnostics. Система OPKO, представленная на рынке как анализатор Claros® 1 с тестом Sangia™ Total PSA), обеспечивает полноценную реализацию принципа «от образца до результата» благодаря герметичному микрофлюидному картриджу, в который вносится образец капиллярной крови, а количественный результат выдается примерно через 10 минут. Система OPKO также демонстрирует возможность мультиплексирования, потенциально включающего определение уровня свободного ПСА и других биомаркеров. Однако в текущем варианте реализации система работает в режиме одиночного анализа (single-plex) для определения общего ПСА, подчеркивая, что при обеспечении коммерческой жизнеспособности устройства приоритет часто отдается четким клиническим показаниям, а не максимальному уровню мультиплексирования. Другим недостатком является высокая стоимость герметичного микрофлюидного картриджа и считывающего устройства, которая составляет около 2500 долларов США.
В мировой и российской практике аллергодиагностики доминируют мультиплексные лабораторные системы (ImmunoCAP ISAC, ALEX, отечественный аллергочип ProAllergy), а также активно разрабатываются новые платформы, в том числе в рамках проекта РНФ «АллергочипРФ» (Сеченовский университет, грант № 23-75-30016). Эти системы обладают высокой чувствительностью и способностью анализировать до 300 аллергенов, но они предназначены для применения в лабораториях квалифицированным персоналом на сложном аналитическом оборудовании и не предусматривают самостоятельного использования пациентами. Таким образом остается потребность в доступном и портативном устройстве для регулярного мониторинга уровня иммуноглобулинов класса Е, отвечающих за развитие аллергического заболевания. Разработка такого устройства, ориентированного на домашнее применение, является актуальной задачей, решение которой повысит качество жизни пациентов с аллергией и снизит нагрузку на систему здравоохранения.
В Российской Федерации наиболее близким аналогом по диагностической задаче является проект «Аллергочип РФ», реализуемый в Первом МГМУ им. И.М. Сеченова. Еще одним отечественным решением является система ProAllergy, разработанная специалистами Московского физико-технического института и медицинского кластера Сколково. Данная платформа относится к классу аллергенных микрочипов и предназначена для мультиплексного определения специфических IgE к широкому спектру аллергенных компонентов. Разработка представляет собой отечественную платформу молекулярной аллергодиагностики, основанную на технологии аллергенного микроматрикса. Суть анализа заключается в том, что на поверхности твердого носителя иммобилизированы аллергены, которые взаимодействуют со специфическими IgE пациента, присутствующими в образце сыворотки крови. Последующая регистрация сигнала меченного комплекса позволяет одновременно определять сенсибилизацию (приобретение организмом повышенной чувствительности к какому-либо веществу или раздражителю) к большому числу аллергенов и формировать индивидуальный профиль аллергической чувствительности.
— Мы опираемся на серьёзный методический и экспериментальный задел. Два ключевых результата последних двух лет — это магистерские диссертации, посвященные определению IgE и белковых маркеров рака простаты. По их итогам у нас появились воспроизводимые протоколы: мы стабильно синтезируем конъюгаты антител с оптическими и флуоресцентными метками для обеих мишеней. Отдельная часть нашей работы — это лазерная гравировка микроканалов в полимере на комплексе LaserPro Mercury III. Здесь мы не только отработали режимы, но и установили зависимости геометрии каналов от параметров печати. Мы сформировали архитектуру наших чипов, где предусмотрены зоны введения образца, конъюгации и детекции, а также капиллярный, пассивный поток жидкости. Для иммобилизации антител мы реализовали два подхода, которые дают высокую плотность покрытия. На базе этих решений созданы модельные тест‑системы (ИХА). Их работоспособность проверили на реальных образцах плазмы и верифицировали результаты с помощью ИФА, — рассказала Ксения Миняйло.
Разработка ученых лаборатории микрофлюидных технологий будет проще в использовании, дешевле в производстве и доступнее как для врачей, так и для пациентов.
Разработка экспресс-чипов для онко- и аллергодиагностики проводится при поддержке программы «Приоритет-2030», а также индустриального партнера — компании «Медико-биологический Союз» (МБС).
Изображения: НГУ
