Дать засохнуть. Африканский комар подсказал секреты сохранения биоматериалов.

Однако интерес тут и практический тоже. Уникальные создания оказываются полезными не только при освоении космических пространств. Знание молекулярных механизмов выживания организмов в экстремальной среде помогает решать многие земные проблемы. Объектом изучения в одном из проектов, выполняемых учеными лаборатории в рамках ФЦП “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы”, стал как раз комар с Африканского континента. Проект называется “Разработка новых подходов в хранении биоматериалов медицинского и сельскохозяйственного назначения”. 

Хирономида, или комар-звонец, — наиболее сложный из известных организмов, способных переносить длительное высыхание. Его личинки — знакомый всем рыбакам мотыль — живут в придонном иле, попадаются на глубине до 300 м. Встречаются они повсеместно, от Антарктиды до Африки. Но в Африке очень короткий период дождей и длинный, до 8 месяцев, сухой сезон. Пересыхает все! Как может живой организм столь долгое время продержаться без воды? Есть разные стратегии выживания: бактерии формируют споры, растения-суккуленты задерживают в себе воду… 

— Хирономида же, наоборот, старается совсем изгнать воду из своего организма, — рассказывает Елена Шагимарданова. — Вместо нее синтезируется сахар трегалоза. Личинка скукоживается, сморщивается, становится совершенно сухой, выглядит как мертвая. Но она жива, хоть и не подает признаков жизни. Любой обмен веществ прекращается, по крайней мере на уровне, который можно обнаружить современными научными методами. И в таком виде хирономида может жить годы. В научной литературе зафиксирован максимальный срок 17 лет, но из разговоров с учеными, которые ее изучают, мы знаем, что по факту он даже больше. Открыли эти свойства в 1951 году, была опубликована статья в Nature. Примерно с тех пор личинки хирономиды лежат в музее Университета Бристоль. Когда их не так давно бросили в воду — некоторые ожили. 

Понимание того, как личинке комара удается так законсервировать себя, чтобы потом вернуться к жизни, может, в принципе, помочь человеку сохранять любые биоматериалы. На решение этой практической задачи и нацелен проект, о котором пойдет речь. Он международный — выполняется совместно с коллегами из Японии. Роли распределены, каждый делает свою часть, после чего следуют обсуждение результатов и совместные публикации. 

Руководитель и проекта, и самой лаборатории экстремальной биологии — кандидат биологических наук Олег Гусев, недавно вышедший из категории “молодой ученый”. С другой стороны проект возглавляет руководитель лаборатории ангидробиоза Национального института агробиологических наук Японии Такахиро Кикавада. 

Когда КФУ стал участником Проекта 5-100, появилась возможность создавать на его базе новые международные лаборатории. Здесь наш длительный опыт взаимодействия с японскими коллегами пришелся кстати, и в феврале 2014 года была открыта лаборатория “Экстремальная биология”. Университет предоставил помещение и финансовую поддержку. Въехали в пустые стены, но уже к концу года все необходимое оборудование было закуплено. Параллельно набирали коллектив. В основном, это была молодежь — только что поступившие в аспирантуру выпускники магистратур КФУ. Еще двое ученых, заинтересовавшись темой, переехали из Саратова. Несколько сотрудников сразу отправились на стажировку в Японию, к партнерам. Сейчас в лаборатории 17 человек, есть свои “спецы” по поддержанию культуры клеток, по геномному анализу, биоинформатике и т.д. К услугам ученых — университетские центры коллективного пользования — протогеномный центр, центр микроскопии.

В середине 2014 года вышла статья по анализу генома хирономиды — результат многолетней совместной работы нескольких коллективов. Было сделано очень много интересных открытий, но перед специалистами встал целый ряд новых вопросов. Из всех стадий развития хирономиды только личинки обладают свойством высыхать и возрождаться. Однако для биотехнологов идеальный вариант — иметь дело не с насекомыми, а с культурой клеток. С ней очень удобно работать: не надо ждать, пока появится очередное поколение личинок, всегда можно проверить любую гипотезу.

Несколько лет назад японским коллегам удалось выделить культуру эмбриональных клеток (то есть клеток из яиц) хирономиды. В природе эти клетки при высокой температуре в отсутствие влаги погибают за секунды. Тем не менее генетически они должны быть способны к высыханию — ведь именно из них потом появляются личинки. Был разработан протокол, позволяющий сохранять эту культуру при высушивании. Сначала ее два дня в специальном режиме держат в дессикаторе, в растворе с высокой концентрацией трегалозы. Клетки впитывают трегалозу, и это запускает молекулярные механизмы, позволяющие культуре высохнуть “правильно” (чтобы потом при увлажнении “ожить”). 

— Наша задача — научиться все это использовать при разработке биотехнологий, которые можно будет применять для хранения биоматериалов, — подчеркивает Елена. — Многие биологические препараты сохраняются лишь при низких температурах: лекарства, банки клеток, банки спермы, банки крови, эмбрионы, органы для трансплантации… Для хранения требуется большое количество энергии, специальное оборудование, возникают трудности с транспортировкой. Это дорого, наконец. А представляете, насколько все станет дешевле и проще, если можно будет высушить кровь, потом растворить ее в воде — и готово, можно переливать! Конечно, мы не научимся за два года проекта высушивать кровь, высушивать сердца… Но даже если удастся чуть-чуть продлить время их хранения, предотвратить или хотя бы замедлить патологические изменения — такой результат уже будет востребован на рынке. А начинать надо с малого. 

Еще до начала этого проекта мы на самих хирономидах изучили их геном. Важно отметить, что в анализ работы генома уникального существа включились лучшие биоинформатические лаборатории России — из МГУ, Сколтеха, Института проблем передачи информации им. А.А.Харкевича РАН. Сейчас перешли к работе на культуре клеток: проверили транскриптационный профиль, посмотрели, как происходит экспрессия генов, какие гены в культуре клеток начинают работать, когда исчезает вода. Клетка в этот момент испытывает сильнейший окислительный стресс — в ней все элементы окисляются, так как без воды начинается утечка электронов с электротранспортной цепи. Окисление во многих случаях для клетки означает смерть. Один из секретов выживаемости хирономиды — очень активная антиоксидантная система. В процессе эволюции хирономида “приобрела” много антиоксидантных белков, которые больше ни у каких насекомых не встречаются. Список генов-антиоксидантов у нее в два-три раза длиннее, чем в известных геномах других насекомых.

Мы можем выбрать минимальный набор генов, необходимый для выживания клеток после высушивания, — некий “сет выживания”. Эту фундаментальную задачу мы решали на первом этапе проекта. Выяснив, какие гены работают, приступили к созданию конструкций с включением этих генов (конструкция — это элемент ДНК, в который встроен нужный ген).

Оказалось, что в клетках при высыхании очень активно синтезируются защитные белки, которые потом связываются с другими белками и защищают их от деградации, когда вода уходит. Если ответственные за синтез этого белка гены перенести в другие виды клеток, эти клетки, в идеале, должны тоже при высушивании оказаться под защитой. Над этим мы сейчас работаем. 

Решают ученые и обратную задачу: стремятся понять, можно ли “заставить” культуру клеток хирономиды сохранять какой-то чужеродный белок, хирономиде изначально не свойственный. В качестве такого “чужеродца” был выбран фермент люцифераза — белок, который при высушивании начинает терять свою биологическую активность, что сразу становится видно, так как он при этом перестает светиться. Ген люциферазы встраивается в конструкцию, которая, в свою очередь, вводится в культуру клеток хирономиды. После того как культура “наработает” чужеродный белок, ее высушивают по всем правилам, потом капают воду и смотрят, есть свечение или нет. В перспективе такой метод может быть использован для производства белковых лекарственных средств, которые не подлежат хранению, — их можно будет синтезировать внутри нашей культуры клеток, высушивать, транспортировать, потом добавлять воду и выделять оттуда белок, он же лекарство. 

Несмотря на то что формально проект, поддержанный ФЦП, заканчивается в 2016 году, его результаты позволили разработать целую “дорожную карту” на ближайшее будущее. Полученный технологический задел будет применен в практических задачах хранения антител, а также для создания методик, позволяющих значительно повысить длительность хранения генетических тестов для медицинских лабораторий. Кроме того, независимая экспертиза комиссий министерств образования и министерств сельского хозяйства Японии и России рекомендовала включить данный проект в программу сотрудничества двух стран в области высоких технологий. Можно надеяться, что сотрудничество российских и японских ученых выйдет на новый уровень.

— Кроме того, в процессе выполнения этого проекта возникло множество новых идей! — делится Елена. — Можно было бы написать добрый десяток небольших статей, но жалко распыляться, хотелось бы еще “покопать”. У нас проектов получается больше, чем рабочих рук. Но так, наверное, во всем мире… Мы привлекаем студентов, они делают у нас курсовые, приглашаем аспирантов. Многие из наших сотрудников ведут хобби-проекты, параллельно с темой диссертации.

Работая с хирономидами, мы освоили геномные технологии, научились читать геномы, а это очень востребовано в медицине. И сейчас у нас появились проекты, уже не связанные с экстремальной биологией, например исследования по заказу онкологического центра. 

В общем, без работы эта лаборатория явно не останется.