Помните, еще в школе нам рассказывали о существах, которых называют простейшими. Таких, как инфузория-туфелька, гидра и, конечно, амеба. Думаете, если уж они простейшие, то изучены, что называется, вдоль и поперек? Оказывается, нет. У той же амебы в запасе еще немало секретов. Но расстаться с ними она готова, если найти к ней особый, генетический подход. Такой подход и стал основным в исследовательском проекте Натальи Бондаренко из Санкт-Петербургского государственного университета, которая использует для изучения амеб особые специфичные гены. Работа молодого ученого поддержана грантом Президента РФ.
Наш корреспондент попытался понять: что же такого сложного в простом?
— Амебы — это, в основном, свободноживущие, реже паразитические одноклеточные организмы, разнообразные по форме и размерам, — объясняет Наталья Ивановна. — Они встречаются повсеместно, населяя все водные и наземные биотопы. Образуют псевдоподии (ложноножки) и перемещаются, используя собственное амебоидное движение. Цитоплазматическое тело этих организмов состоит из оптически прозрачной гиалоплазмы, не несущей включений, и гранулоплазмы, в которой содержатся органеллы, пищеварительные вакуоли и другого рода включения. Гиалоплазма и гранулоплазма — не резко разграниченные части. Они могут превращаться друг в друга. Кстати, среди амеб встречаются не только одноядерные, но и многоядерные виды.
Амебы не имеют строгой пищевой “специализации” и питаются бактериями, одноклеточными водорослями, другими простейшими и их цистами (временная форма существования организмов при возникновении неблагоприятных условий окружающей среды с образованием защитной оболочки). Разнообразие амебоидных организмов не ограничивается широким спектром локомоторных форм, которые принимает клетка при движении. Один из важных признаков — строение поверхности клетки. Ее плазматическая мембрана, как и у других эукариотических клеток, покрыта слоем полисахаридов, это так называемый гликокаликс. У некоторых амеб он представляет собой однородный слой, равномерно покрывающий клетку. Представители родов Vannella, Vexillifera имеют более сложную структуру поверхности клетки. У этих групп плазматическая мембрана покрыта регулярно расположенными пентагональными и гексагональными структурами, погруженными в однородный слой полисахаридов. Еще более сложной организации поверхности клетки достигли группы отряда Dactylopodida и Hematismenida. Их представители предварительно синтезируют самые разные сложные, например лодковидные, структуры — чешуйки, которые транспортируются на поверхность клетки, образуя уникальный рисунок покрова клетки у разных родов амеб. И наконец, самая сложная организация внеклеточных покровных структур — у раковинных амеб, цитоплазматическое тело которых заключено в раковину. Эти организмы перед делением клетки синтезируют строительный материал или накапливают его, поглощая мелкие песчинки или кремниевые панцири других простейших из внешней среды. Непосредственно перед делением у раковинных амеб происходит синхронный выброс строительного материала из цитоплазмы клетки на ее поверхность. Так формируется раковина, например, у амеб родов Arcella и Difflugia
— Каким образом вы изучаете амеб?
— Наша группа под руководством Алексея Валерьевича Смирнова на протяжении многих лет исследует представителей типа Amoebozoa. География сбора проб у нас очень большая — это водоемы и Европы (Германия, Швейцария, Франция, Италия), и европейской части России (озера и реки Московской и Ленинградской областей, Карелии, Валаамского архипелага, Республики Татарстан, Краснодарского края). В восточной части нашей страны мы собирали пробы на Амуре, Зее, Ангаре, Иркуте, Байкале. Есть несколько проб из водоемов Японии, Израиля и с островов Карибского бассейна, Азорских островов. После того как пробы оказываются в лаборатории, первоочередная наша задача — получить чистые монокультуры интересующих нас видов. Для этого мы высеваем пробы в чашки Петри со специальной питательной средой и культивируем при комнатной температуре от
3 до 5 дней. Затем путем многократного пересева единичных клеток получаем чистые монокультуры. А вообще-то не все виды амеб легко культивируются в лабораторных условиях.
— Какая необходимость в новых исследованиях этих существ?
— С момента открытия амеб в 1755 году Августом Розенгофом и по настоящее время классификация этих одноклеточных организмов претерпела множество изменений. В последнее десятилетие стало очевидным, что возможности описания, классификации и систематизации, опиравшиеся исключительно на морфологические признаки, практически исчерпаны. Такие признаки позволяют достаточно надежно очертить роды амеб, но во многих случаях невозможно достоверно различать виды из-за значительной внутривидовой изменчивости, которая часто перекрывает межвидовую. Подобная ситуация делает невозможными серьезные популяционные, биогеографические и экологические исследования амеб и приводит к тому, что амебы зачастую полностью выпадают из поля зрения исследователей. Такая ситуация в первую очередь связана с небольшим числом морфологических признаков, так или иначе доступных для наблюдения. Если оценить набор признаков, которые можно принять во внимание при идентификации голых амеб (включая как светомикроскопические, так и ультраструктурные признаки), то их окажется не более 30, а каждый отдельно взятый вид распознается максимум по 5-7 признакам. При этом серьезной проблемой у амеб зачастую является оценка состояния признака. Амеба динамична и все время видоизменяется, а современная морфология практически не имеет языка описания, специализированного для динамических объектов. Поэтому исследователям приходится довольствоваться весьма нечеткими качественными характеристиками, такими как “локомоторная форма, вееровидная, лопатовидная или полукруглая”. Неудивительно, что при таком уровне разрешения наиболее четко очерченным таксоном амеб оказался род, а выделение видов в пределах одного рода всегда было проблемой. Все это приводит к тому, что число видов амеб, обнаруженных при исследованиях схожих мест обитания, варьируется в десятки раз.
— Расскажите о задаче, которую вы поставили перед собой.
— Мы хотим решить фундаментальную проблему, связанную с понятием вида у голых лобозных амеб, используя сочетание молекулярно-биологических, биоинформатических и морфологических методов исследований. Планируем в течение ближайших двух лет найти молекулярные маркеры — Amoebozoa-специфичные гены (или по-другому гены ДНК-баркоды), надежно отграничивающие друг от друга морфологические виды амеб. И так разрешить проблему внутривидового генетического полиморфизма. С помощью маркерных генов и техники анализа тотальной ДНК, выделенной из природных местообитаний, мы сможем определить, какое количество видов амеб остается “скрытым” в природных местообитаниях по сравнению с результатами морфологических исследований. На основании этих данных оценим общую степень изученности различных групп амеб и потенциальное количество “видов” голых амеб в природе. Благодаря таким данным мы сможем разработать синтетические молекулярно-морфологические критерии вида для лобозных амеб. Эти критерии позволят надежно выделять и идентифицировать изоляты таких амеб как на морфологическом, так и на молекулярном уровне и идентифицировать нуклеотидные последовательности маркерных генов лобозных амеб, полученные в результате молекулярных экологических исследований.
— Что вы уже сделали в этом направлении?
— Наши предыдущие исследования показали, что для амеб характерен необычайно высокий уровень отличий в последовательности ДНК общепринятого маркерного гена малой субъединицы рибосомальной РНК (18SрРНК). Кроме того, выяснилось, что этот ген у амеб чрезвычайно трудно амплифицировать (амплификация — накопление копий ДНК в процессе полимеразной цепной реакции) из экстрактов тотальной ДНК. Для нас стало очевидно, что надо искать какие-то другие гены, которые могут служить надежными маркерами вида у амеб. В качестве кандидата мы выбрали ген субъединицы I цитохромоксидазы (СохI). Этот ген широко используется для подобных целей как у протистов, так и многоклеточных организмов, но у амеб его еще не изучали.
Мы уже выбрали хорошо определяющийся морфологический вид амеб и подготовили библиотеку его штаммов, изолированных из удаленных друг от друга географических точек. Сейчас проводим амплификацию и секвенирование Cox1 гена для каждого штамма. Это позволит оценить уровень его полиморфизма как внутри локальных популяций вида, так и между ними.
Одновременно с этими исследованиями мы ведем поиск новых генов-кандидатов. Провели de novo сборку транскриптомов 12 видов амеб с последующим ab initio предсказанием генов и их функций. Анализ кластеризации ортологичных генов (гены — гомологи филогенетически родственных организмов) выявил несколько групп генов потенциальных ДНК-баркодов, присущих исключительно Amoebozoa.
— Какую научную проблему помогут решить ваши исследования?
— В последние годы популярной областью исследований становится молекулярная экология — анализ проб ДНК из природных местообитаний. Благодаря внедрению молекулярных методов в практику полевых исследований стало ясно, что огромное количество видов и даже целые крупные группы прокариот и протистов выявляются только в виде генотипов, присутствующих в экстрактах ДНК из различных проб. Соотнести многие полученные из природных местообитаний нуклеотидные последовательности с каким-либо объектом, известным и описанным на морфологическом уровне, не удается. Полученные нами данные по новым генам ДНК-баркодам позволят применить их на практике. Станет доступной информация о реальном видовом составе сообществ, можно будет предсказать такие важные параметры природных экосистем, как “робастность” сообществ — способность системы противостоять резким изменениям окружающей среды и восстанавливать свои функции в биогеоценозе после стрессовых естественных или антропогенных воздействий. Также это позволит нам оценить наличие потенциально патогенных видов протистов в “безобидном” (по данным исследований, выполненных классическими методами) биогеоценозе и принять меры, которые исключат их активное размножение в случае изменения условий в местообитании.
Фирюза ЯНЧИЛИНА
Фото предоставлено Н.Бондаренко
Нет комментариев